分辨率达到50nm！我国已具备高端超分辨光学显微镜研制能力_风闻

来源：微信公众号“科学大院” 作者：苏州医工所

一听到高端的光学显微镜，你是不是会立刻想到徕卡、蔡司、奥林巴斯这些国外品牌？现在，我国也具备了高端超分辨光学显微镜的研制能力。

中国科学院苏州生物医学工程技术研究所（简称“苏州医工所”）已经研制出了激光扫描共聚焦显微镜、双光子显微镜、受激发射损耗(STED)超分辨显微镜、双光子-STED显微镜等高端光学显微镜。

12月26日，由苏州医工所承担的国家重大科研装备研制项目“超分辨显微光学核心部件及系统研制”通过验收，标志着我国具备了高端超分辨光学显微镜的研制能力。

科研人员正在用自主研制的激光扫描共聚焦显微镜观察细胞结构（图片来源：中科院摄影联盟、苏州医工所）

探索微观世界 离不开高端显微镜

高端显微系统广泛应用于生物学和基础医学等相关前沿领域的创新研究，尤其是10-100nm尺度的超分辨显微光学成像技术，在当今生物学和基础医学研究中，发挥着不可替代的作用。

作为生物医学实验研究的必备工具，激光扫描共聚焦显微镜比传统的荧光显微镜分辨率更高，而且可以进行层析扫描3D成像。但是共聚焦显微镜能够观察的样品厚度一般小于100um，要观察更深的样品时需要借助双光子显微镜。双光子显微镜最大的优势是观察的深度。

但是无论是激光扫描共聚焦显微镜还是双光子显微镜，都无法摆脱衍射极限的限制，为了进一步探索微观世界，需要分辨率更高的显微镜。STED显微镜应运而生，它在共聚焦显微镜的基础上引入损耗光束将荧光光斑进一步压缩，从而实现超分辨成像。

数值孔径为1.45的平场复消色差显微物镜（图片来源：中科院摄影联盟、苏州医工所）

我们都知道，美国和日本都是诺贝尔奖大国，日本从2000年开始基本每年一个诺贝尔奖，其中的原因之一就是离不开显微镜等高端仪器的使用。我国虽然是显微镜消费大国，但自己只能生产中低端产品，高端仪器基本依赖于进口，这已经严重制约了我国生物学和基础医学等相关前沿领域的创新研究。

四台高端显微镜 Made in China！

历时五年攻关，苏州医工所科研人员全面突破大数值孔径物镜、特种光源、新型纳米荧光增强试剂、系统集成与检测等关键技术，研制出四台高端显微镜，为我国高端光学显微镜的发展提供了系统解决方案。

高端平场复消色差生物显微物镜（图片来源：中科院摄影联盟、苏州医工所）

下面我们就来看看这四大国货神器吧！

1. 激光扫描共聚焦显微镜

传统荧光显微镜是用光源照射整个样品平面，再获得图像。由于聚焦平面上下的平面也会受到激发产生荧光，图像会被干扰；同时，同一平面上特征点周围激发的荧光也会干扰特征点的观察。

**激光扫描共聚焦显微镜采用聚焦后的激光光斑作为照明光源，同时在探测器前引入针孔将聚焦光斑外的干扰信号进行过滤，因此提高了图像信噪比，横向分辨率可达200nm左右。**此外，激光共聚焦显微镜还可以对样品逐层扫描实现三维成像，以及利用多通道采集图像的功能同时获取不同光谱段的荧光扫描图像。

激光扫描共聚焦显微镜与普通荧光显微镜成像对比（图片来源：网络）

苏州医工所研制的激光扫描共聚焦显微镜样机（图片来源：苏州医工所）

激光共聚焦显微镜可以观察细胞或亚细胞形态结构、鉴定细胞或组织内生物大分子，如：检测蛋白质抗体及其他分子，检测细胞凋亡，观察细胞骨架结构等；还能进行活体细胞或组织功能的实时检测。

目前，利用苏州医工所研制的高端光学显微镜，中科院动物所观察发育生物学中的基本现象，研究潜在调控机制；中科院药物所观察药物胞内靶向定位和输送，加速创新性新药研发。

纳米药物在Caco-2细胞亚细胞器分布共聚焦成像

（图片来源：中科院上海药物所）

  小鼠卵母细胞纺锤体共聚焦成像

（图片来源：中科院动物所）

2.双光子显微镜

双光子显微镜结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的特点。

双光子激发技术的基本原理就是用两个波长较长的光子去激发一个荧光分子。由于光波波长较长，可实现成像深度超过600微米。那么问题来了，什么情况下可以用两个光子激发一个光子，实现能量叠加呢？答案是：提高光子密度。

在进行双光子成像时，物镜焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点附近很小的区域内，邻近区域不产生荧光，因此不需要针孔过滤信号，提高了信号收集效率。

单光子（共聚焦）激发与双光子激发（图片来源：网络）

苏州医工所研制的双光子样机图（图片来源：苏州医工所）

目前双光子成像在生物医学领域广泛应用于深层组织成像以及活体成像等。美国斯坦福大学、日本东京大学、陆军军医大学脑科学研究中心等专业实验室利用双光子显微成像技术进行了信息识别、行为控制等脑科学核心问题的研究以及动物在体成像实验，获得了高分辨实时神经元活动成像数据。

CLARITY处理的Thy1-YFP（H Line）小鼠大脑的荧光观察

（A）从大脑皮质到海马的3-D观察图像

（B）大脑皮层Ⅴ层的锥体细胞的树突图像（图片来源：网络）

3.受激发射损耗（STED）显微镜

传统光学成像由于受到光学衍射极限的限制，分辨率很难突破200nm。这时就需要超分辨显微镜出手了。

光学衍射极限降低分辨能力（图片来源：网络）

STED显微镜是一种超分辨显微镜，它的原理可以简单理解为在共聚焦显微镜的基础上加入一束面包圈状的光斑（我们称之为损耗光），通过受激辐射效应减小有效荧光发光面积，将被激发的荧光物质限制在衍射极限内，从而突破光学衍射极限实现超分辨成像，目前能够实现50nm分辨率。

STED原理（图片来源：网络）

细胞骨架共聚焦与STED对比图（图片来源：苏州医工所）

苏州医工所研制的STED样机图（图片来源：苏州医工所）

STED显微镜的应用领域与共聚焦显微镜相似，主要用于观察亚细胞形态结构，活细胞内生物分子的实时成像和动态跟踪等。目前，苏州医工所正与中科院上海药物所以及中科院北京动物所开展相关合作。

4.双光子STED显微镜

双光子STED显微镜将双光子显微镜与STED显微镜合二为一，结合双光子显微镜成像深度深以及STED显微镜分辨率高的优点，根据不同的成像需求选择合适的成像方式。

苏州医工所研制的双光子-STED显微镜（图片来源：苏州医工所）

目前，苏州医工所已联合吉林大学第一医院、复旦大学附属华山医院以及苏州大学附属第一医院针对难治性癫痫、帕金森病及缺血性脑卒中疾病等进行研究。

科研人员正在用自主研制的双光子-STED显微镜观察亚细胞结构（图片来源：中科院摄影联盟、苏州医工所）

小鼠脑切片双光子成像（图片来源：苏州医工所）

导师，咱们实验室也买一台？

在高端显微镜的研制过程中，设计、加工、装配、检测等等，并无现成标准、经验可循；关键光学器件的加工难度超乎想象。

这次通过项目验收的四套超分辨率显微镜，最高分辨率达到了50纳米，而且各有特色。“在它们的背后，是已经发展起来的显微光学设计、加工、制造、装配的完整技术和工程体系。”例如大数值孔径显微物镜，不过两个胶囊咖啡大小的物镜，却由十几片直径为1-30毫米的特种玻璃镜片装配而成，做出这样一个镜头，需要解决一系列难题，更需要精密的检测设备和严格的检测标准。

高精度显微物镜光学元件加工（图片来源：中科院摄影联盟、苏州医工所）

目前，苏州医工所研制的显微镜和关键部件已有部分成果实现销售，例如：双光子显微镜已销往德国、以色列、美国等多家国外研究机构。北京大学、中科院神经科学研究所等国内科研机构也使用了该设备。具有自主知识产权的特种LED光源体系具备了国际竞争力，支撑了包括新一代投影、光医疗仪器以及远程照明等新兴产业的快速发展。共聚焦显微镜也已完成工程化，拟进行产业化生产和销售。

该项目的成功实施，极大改善了我国高端光学显微镜基本依赖进口的状况，对满足我国生物医学等前沿基础研究的定制化需求、提升创新能力，以及推动我国光学显微镜行业转型升级具有重要的战略意义。

作者单位：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所